E' necessario osservare un digiuno di almeno 8 ore e di non fumare, è ammessa l'assunzione di una modica quantità di acqua. I livelli di ACTH presentano un significativo ritmo circadiano. (livelli più bassi tra le 21 e le 22, livelli più elevati tra le 6 e le 8) Per questo motivo è importante standardizzare l'ora del prelievo.